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Fructose-Konzentration der Probe berechnen
Um die Fructose-Konzentration in der Probe zu berechnen, nutzen wir die Änderung in der Extinktion, die durch die Zugabe von Hexosephosphat-Isomerase (HPI) beobachtet wurde. Diese Änderung in der Extinktion ist direkt proportional zur Menge der umgesetzten Fructose, da HPI die Umwandlung von Glucose-6-phosphat (G6P) zu Fructose-6-phosphat (F6P) katalysiert und die Extinktionsänderung auf die Bildung von NADPH bei der nachfolgenden Oxidation von G6P zu 6-Phosphogluconolacton durch Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) zurückzuführen ist.
Für die Berechnung der Konzentration benötigen wir die molare Extinktionskoeffizienten von NADPH bei 365 nm, welche üblicherweise \(6,22 \times 10^3 \, \text{M}^{-1} \cdot \text{cm}^{-1}\) beträgt, und die Gesamtvolumen- und Probenvolumenverhältnisse, um die tatsächliche Probenkonzentration zu bestimmen.
Die relevante Extinktionsänderung für die Bestimmung der Fructose-Konzentration ist der Anstieg nach der Zugabe der Hexosephosphat-Isomerase von 0,500 auf 0,656, also \( \Delta E = 0,656 - 0,500 = 0,156 \).
Die Formel für die Berechnung der Konzentration ist:
\(
C = \frac{\Delta E}{\epsilon \times d}
\)
Dabei ist \(C\) die Konzentration von NADPH (und damit indirekt die Fructose), \( \Delta E \) die gemessene Extinktionsänderung, \( \epsilon \) der molare Extinktionskoeffizient von NADPH bei 365 nm, und \(d\) die Schichtdicke der Küvette (1 cm).
Einsetzen der Werte:
\(
C = \frac{0,156}{6,22 \times 10^3 \cdot 1} \approx 2,51 \times 10^{-5} \, \text{M}
\)
Die Extinktionsänderung repräsentiert die Konzentration von NADPH, welche der Konzentration der umgesetzten Fructose entspricht, in der Endmischung.
Da die Probe nur 20 μl in einem Gesamtvolumen von 675 μl (600 μl + 20 μl + 50 μl + 5 μl) ausmacht, muss die berechnete Konzentration entsprechend angepasst werden, um die ursprüngliche Fructose-Konzentration in der Probe zu bestimmen:
\(
\text{Probenkonzentration} = C \times \frac{\text{Gesamtvolumen}}{\text{Probenvolumen}} = 2,51 \times 10^{-5} \, \text{M} \times \frac{675 \, \mu\text{l}}{20 \, \mu\text{l}} \approx 8,41 \times 10^{-4} \, \text{M}
\)
Beschreibung der Reaktionsgleichungen
(a) Hexokinase Reaktion:
\( \text{Glucose} + \text{ATP} \rightarrow \text{Glucose-6-phosphat} + \text{ADP} \)
(b) G6PDH Reaktion:
\( \text{Glucose-6-phosphat} + \text{NADP}^+ \rightarrow 6-\text{Phosphogluconolacton} + \text{NADPH} + \text{H}^+ \)
(c) HPI Reaktion (relevant für Fructose-Umwandlung):
\( \text{Fructose-6-phosphat} \leftrightarrow \text{Glucose-6-phosphat} \)
Grund der Extinktionsänderung nach Zugabe der Hexokinase/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Die Extinktionsänderung nach Zugabe der Hexokinase/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Lösung beruht auf der Bildung von NADPH in der Reaktion, die von G6PDH katalysiert wird. NADPH absorbiert Licht bei 365 nm stark, daher führt die Zunahme der NADPH-Konzentration im Verlauf der Reaktion zur Erhöhung der gemessenen Extinktion bei dieser Wellenlänge.
